Publication: Búsqueda de nuevas toxinas de Bacillus Thuringiensis mediante la utilización de una línea de Aedes aegypti resistente.
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Date
2004
Authors
Orduz Peralta, Sergio
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Abstract
La incidencia del dengue, fiebre hemorrágica de dengue y síndrome de shock de dengue ha aumentado en los últimos años en la mayoría de los paises tropicales donde mosquitos del género Aedes son los principales vectores. Las estrategias de control por métodos químicos no han dado los resultados que se esperaba, y los altos costos de operación de este tipo de campañas permiten pensar que en el futuro los problemas se puedan agravar. Algunas bacterias entomopatógenas tambien se han incorporado a los programas de control como es el caso de Bacillus thuringiensis y Bacillus sphaericus. Sinembargo el uso de B. sphaericus en programas operativos de control de mosquitos vectores de enfermedades ha originado el desarrollo de resistencia en mosquitos de la especie Culex quinquefasciatus en India, Francia y Brasil (Rao et al., 1995, Regis et al., 1995); mientras que a nivel de laboratorio se ha demostrado que la resistencia de esta misma especie de mosquito a las toxinas de la bacteria B. thuringiensis subesp. israelensis (Georghiou and Wirth, 1997). Y más aún, tambien bajo condiciones de laboratorio se ha reportado resistencia cruzada en estas poblaciones de mosquitos a la toxina Cry11Ba1 de B. thuringiensis subesp. jegathesan. (Wirth et al., 1998). Por lo tanto se hace necesaria la búsqueda de nuevas cepas de B. thuringiensis mosquitocidas mediante un esquema de evaluación más ágil y riguroso.
El objetivo de esta propuesta de investigación es seleccionar cepas de B. thuringiensis que expresen toxinas nuevas mediante su evaluación con una línea de Aedes aegypti resistente a las toxinas de Bacillus thuringiensis subesp. israelensis.
La colonia de A. aegypti a ser usada en esta investigación fue establecida en 1991. El insectario donde se mantiene la colonia tiene un área de 120 m2 y necesita ser adecuado para regular las condiciones de humendad, temperatura y fotoperíodo. Para los experimentos de selección se producirá un lote de 11 litros de la bacteria B. thuringiensis subesp. israelensis que expresa las toxinas Cry4Aa, Cry4Ba, Cry11Aa y Cyt1Aa de acuerdo a la metodología desarrollada por Vallejo et al., (1999). El fermentado será concentrado por ultrafiltración tangencial y será secado en un mini spray dryier. Este polvo será almacenado a -20oC hasta su uso.
Con el propósito de medir la potencia de la preparación que contiene las toxinas de B. thuringiensis subesp. israelensis y la susceptibilidad incial de la colonia de A. aegypti, se realizarán bioensayos con larvas de 3 dias de edad de A. aegypti. Como mínimo se usarán 5 concentraciones que den valores de mortalidad entre el 5 y el 98% a las 24 horas despues de la exposición a las toxinas. Cada dilución se evaluará por tripilicado y los bioensayos se realizarán en 3 dias diferentes. Los resultados de mortalidad serán evaluados por análisis Probit para determinar la concentración letal media (LC50) y la concentración letal 95 (LC95).
La selección de la primera generación se realizará de acuerdo a la metodología empleada por Georghiou y Wirth (1997). La presión de selección será ajustada cada generación para producir 15 a 20% de sobrevivientes y obtener no menos de 5000 sobrevivientes en cada generación de selección, para lograr así, de 500 a 1000 adultos. Los sobrevivientes serán transferidos a bandejas con agua limpia y con comida para obtener pupas y adultos. El mantenimiento de una base de reproducción relativamente grande disminuirá la posibilidad de la aparición de deriva y cuellos de botella genéticos. Los bioensayos para determinar el nivel de resistencia basado en el LC50 y el LC95 se realizarán cada 3 generaciones. Durante el año de trabajo propuesto para la selección se espera realizar experimentos en 28 generaciones. El radio de resistencia (RR) de las poblaciones seleccionadas se calculará como el LC50 de la población resistente dividido por el LC50 de la población sin seleccionar. En la mediada en que el RR sea gande, mayor será la resistencia desarrollada.