Código: M301PR03FO8 . INFORME TÉCNICO DE AVANCE O FINAL DE PROGRAMAS Y Versión: 02 PROYECTOS DE CTeI Fecha: 2019-02-08 Página 1 de 30 1. IDENTIFICACIÓN DEL PROGRAMNPROYECTO 1.1 Información General Programa [11 Proyecto [Kl Tipo de informe: Parcia[I Final Informe Nc[I] d[II] RANSPORTE IÓNICO MEDIADO POR ATPasas tipo P EN LA MEMBRANA PLASMÁTICA DE ítulo L4ycobacterium tuberculosis. FASE 2: BLANCOS DE ATENUACIÓN Y VIABILIDAD ódigo 110171250419 Número de la convocatoria 112-2015 CONVOCATORIA PARA PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN EN CIENCIAS BÁSICAS Número de contrato :P44842 108 2016 Programa Nacional o área de Colciencias al cual ROGRAMA NACIONAL EN CIENCIAS BÁSICAS e encuentra adscrito el proyecto Nombre del investigador principal arIos Yesid Soto Ospina Entidades ejecutoras y beneficiarias JNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA - SEDE BOGOTÁ Fecha de inicio del programa/proyecto lunio 13 de 2016 Fecha de entrega del informe Noviembre 13 de 2019 iudad/Pais 3ogotá D.0 / Colombia TABLA DE CONTENIDO RESUMEN La tuberculosis (TB) es una enfermedad causada por Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis); en la actualidad, aproximadamente la tercera parte de la población mundial se encuentra infectada con M. tuberculosis, lo que produce cerca de 2 millones de muertes cada año. La TB latente, junto a la actual pandemia de VIH-SIDA y la aparición de cepas de M. tuberculosis multi-fármaco y extremadamente fármaco resistentes (MDR y XDR) a los antituberculosos (anti-TB) usados actualmente, dificultan el control de esta enfermedad. A pesar de que existen en prueba nuevos medicamentos anti-TB y se han desarrollado candidatos a vacuna, Código: M301 PRO3FO8 INFORME TÉCNICO DE AVANCE O FINAL DE PROGRAMAS Y Versión: 02 PROYECTOS DE CTeI Fecha: 2019-02-08 Página 2 de 30 estamos muy lejos de alcanzar un efectivo control de la TB. Para contribuir con este propósito, es fundamental descubrir marcadores biológicos alternativos involucrados tanto en la viabilidad del bacilo tuberculoso, tanto en la infección activa como en la infección latente. Recientes estudios han sugerido que el transporte jónico de M. tuberculosis mediado por enzimas ATPasas tipo P -es actvado por diferentes condiciones de estrés relacionadas -con la respuesta de las células hospedadoras a la infección, como por ejemplo por sustancias tóxicas, hipoxia, etc. M. tuberculosis posee un número inusualmente alto de ATPasas tipo P ffl posibles ORFs), sugiriendo su participación en la virulencia y viabilidad del bacilo tuberculoso, Nuestro -grupo de investigación Bioquímica y Biología Molecular de las Micobacterias (BBMM) de la Universidad Nacional de Colombia, en los ultimos años 'ha sido pionero en el -estudio de la especificidad del transporte jónico mediado por ATPasas tipo P en las micobacterias. En la 'Fase 1 'de este proyecto, mediante aproxiruaciores bioiníormáticas pudimos dasificar las AT-Pasas tipo P de M. tuberculosis en dos grandes grupos: i) transportadores de iones 'de metales alcalinos/alcalinotérreos como Na, K y Ca2 y u) transportadores de iones de metales pesados como CU2+, Cu, Co2 , Ag, Cd2 y Pb2 . También encontramos indicios de que los transportadores CtpF, CtpE y CtpH de M. tuberculosis están relacionada con el eflujo de Ca2 , la tolerancia a concentraciones tóxicas de NaiK y la 'respuesta a condiciones de iipoxia, lo que indujo postular la posible implicación de estos transportadores 'de metales alcalino/alcalinotérreos en 'la atenuación 'de .M. tuberculosis. Respecto al transporte de metales pesados, establecimos una relación entre 'la actividad de CtpA y CtpG 'de M. tuberculosis y la 'tolerancia de las micobacterias a concentraciones tóxicas de Cul sugiriendo una posible implicación de estos transportadores de membrana en la viabilidad de M. tuberculosis, Un meta-análisis de los resultados reportados sobre -el comportamiento transcripcional de las AT-Pasas tipo P de M. tuberculosis bajo diferentes condiciones experimentales, nos ayudó a seleccionar los transportadores de metales alcalinos/alcalinotérreos CtpF y CtpE, y de metales pesados CtpA y Ctp'B, como posiblemente relevantes -en la atenuación y/o viabilidad de M. tuberculosis respectivamente. Por lo tanto, se inició la construcción de mutantes de ATPasas tipo P, para su -caracterización. Una nueva fase-de esta investigación Fase 2, presente proyecto) propone evaluar la capacidad infectiva de mutantes de M. -tuberculosis defectivos en posibles transportadores de -Cafl, Na, K y/o Cu, en el modelo celular de macrófagos murinos, para así conocer la relación 'de estos transportadores en la atenuación de M. tuberculosis. Algunas de estas cepas se utHizaron para realizar estudios funcionales mediante absorción atómica para determinar la acumulación -de iones -metálicos al interior de la micobacteria, y de esta forma conocer si realmente estos transportadores están asociados a la disminución de la ATPasas -tipo P de membrana plasmática y a la viabilidad de las micobacterias. También estudios sobre posibles cambios transcripcionales de las ATPasas tipo P•de M. tuberculosis en respuesta a condiciones -de estrés relacionadas con la infección tuberculosa como: tiipoxia, inanición, concentraciones tóxicas de cationes metálicos, y especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, y acumulación de metales en células -de micobacteria sobreexpresando o 'defectivas -de -estos transportadores, se realizaron para encontrar posibles efectos compensatorios en el transporte mediado por ATPasas tipo P en la membrana plasmática de las micobacterias, 'lo anterior se coniplementó con otros estudios funcionales para cacterizar con mayor detalle la especificidad iónica de -estos transportadores. El -objetivofinal es-establecer, .apoyado con estudios in silico, el potencial de las ATPasas tipo P como dianas claves en el diseño de nuevos compuestos anti-TB o posibles cepas atenuadas 'rJeM. 'tuberculosis-con potencial vacunal. El desarrollo de este proyecto apoyó la formación de estudiantes de Doctorado -en Ciencias-Química y Ciencias-Bioquímica, Maestría en Ciencias- Bioquímica y pregrado en Química, de la Universidad Nacional de Colombia. En este trabajo interdisciplinar-io -se articularon 'dos gritpos 'de investigación nacional, con asesoría internacional que sin duda contribuiyó -a obtener fesultados novedosos en ciencias biomédicas para la región. 4. SINOPSIS TÉCNICA En el proceso de caracterización de las ATPasas tipo P seleccionadas, lo primero -que se realizó fue corroborar la -especificidad iónica -de las enzimas en-estudio (CtpF, CtpE, CtpA y CtpB). Para lograr este objetivo, la estrategia general para todas ellas fue la misma: Primero, .donar los genes de las diferentes lTPasas-de M. tuberculosis en los vectores pBA1J y pMV261, lo que permite la expresión de las proteínas -en Escherichia coli y Mycobacterium smegmatis, -respechvamente. Código: M301 PR03FO8 _-j INFORME TÉCNICO DE AVANCE O FINAL DE PROGRAMAS Y Versión: 02 PROYECTOS DE CTeI Fecha: 2019-02-08 Página 3 de 30 Segundo, determinar la actividad ATPasa de las proteínas expresadas, inducida por los potenciales iones transportados a través la membrana plasmática. Tercero, determinar mediante ensayos de viabilidad bacteriana, el efecto de la sobreexpresión de las proteínas en la tolerancia de las micobacterias a concentraciones tóxicas de los posibles iones transportados. Cuarto, determinación de sus constantes cinéticas y Kcat. Quinto, sobreexpresar y aislar las proteínas recom bin antes embebidas en la membrana plasmática. Sexto, realizar ensayos de acumulación de metales después de tratar las distintas cepas con altas concentraciones de los distintos metales potencialmente transportados. Para el transportador CtpF de M. tuberculosis se encontró que la hidrólisis de ATP fue dependiente de Na, K y principalmente de la concentración de Ca2 en el medio de reacción, con gran afinidad por este catión (Km 0,27 pM y Vmax de 357±0,20 nmol/mg.min). Además, la cepa M. smegmatis recombinante sobreexpresando ctpF fue más tolerante a concentraciones subletales de Ca2 y Na, en comparación a los demás iones probados. Todo lo anterior sugiere que CtpF es una Ca2 ATPasa tipo P (Anexo 1 y 6). Los estudios realizados para CtpE sugieren que esta enzima es una Na o K ATPasa que puede hacer parte de la respuesta micobacteriana al choque osmótico que enfrenta la bacteria en el transcurso de la infección. La sobreexpresión de la proteína confirió tolerancia a la cepa recombinante frente a concentraciones sub-letales de Na (200-250 mM). La actividad ATPasa de vesículas de membrana plasmática enriquecidas con CtpE aumentó en función de la concentración de Nal y K siguiendo una cinética de Michaelis-Menten. Bajo condiciones óptimas de actividad (37°C, pH 7,4 y 30 minutos) se determinaron los valores de Km y Vmax para los posibles sustratos: Na* (Km de 1089±37,4 pM y Vmax de 3,4±0,2 nmol P/min.mg.); K (Km de 19,6±2,8 pM y Vmax de 3,16±0,07 nmol P/min.mg.); ATP (Km de 93,8±12,8 pM y Vmax de 11,1±0,4 nmol P/min.mg); y susceptibilidad a la inhibición con vanadato con un 1050 de 24,9 pM. Estos resultados, así como los valores de Kcat sugieren que CtpE participa en el transporte activo de Na (Anexo 2). En el caso de CtpA se observó que la actividad ATPasa es estimulada al añadir al medio de reacción Cu y Ni2 . Se encontró una mayor estimulación al usar como sustrato Cul y las constantes cinéticas de la enzima para este catión estimadas son Km = 4,68 x 10-2 pM, Vmax = 10,3nmol/mg.min y h de 1,91. Adicionalmente, al sobreexpresar CtpA en la cepa M. smegmatis se observó mayor tolerancia a Cu2 (el que posiblemente es reducido a Cu en el interior celular) en comparación a los demás iones probados. Todo lo anterior sugiere que CtpA es una Cu-ATPasa (Anexo 3). Para el caso de CtpB hubo una estimulación de la actividad ATPasa al adicionar Cu, en el medio de reacción, ylas constantes cinéticas de la enzima al usar este ion como sustrato son Km = 0,19 pM y Vmax = 2,29 ± 0,10 nmol/mg.niin. Además, la cepa M. smegmatis sobreexpresando ctpB presentó mayor tolerancia a Cu, en comparación a los demás iones probados. Todo lo anterior sugiere que CtpB es una Cu+-ATPasa (Anexos 4 y 7). Por otra parte, al sobreexpresar los transportadores CtpF y CtpE en E. coli, y purificar las proteínas mediante cfomatografia de afinidad, se observó que la actividad de las enzimas se pierde significativamente con el tiempo (Anexos 1 y 2), lo que dificultó el estudio de sus constantes cinéticas utilizando el sistema de proteína recombinante reconstituida en liposomas. Para solucionar este inconveniente, se decidió determinar la influencia de los diferentes cationes en la actividad ATPasa utilizando un sistema mucho más aproximado a las condiciones naturales de estos transportadores, o sea, su expresión en la membrana plasmática micobacteriana (Anexos 1, 2 3, 4, 6, 7, 9 y 20), lo que nos permitió poder determinar las constantes cinéticas, esenciales para asignar la especificidad iónica de cada uno de estos transportadores. También se realizó un análisis de¡ efecto de algunas condiciones de estrés relacionadas con la infección tuberculosa como: flipoxia, inanición, concentraciones tóxicas de cationes metálicos, y especies reactivas de oxigeno y nitrógeno, en la actividad transcripcional de los transportadores CtpF, CtpE, CtpA y CtpB, además de otros como CtpD, ctpE, ctpH, ctpJ y ctpG. También se evaluó el perfil transcripcional de algunas de ellas bajo concentraciones tóxicas de metales pesados. Como 'Código: M301PR03FO8 INFORME TÉCNICO DE AVANCE O FINAL DE PROGRAMAS Y Versión: 02 PROYECTOS DECTeI Fecha: 2019-02-08 Página 4 de 30 dato importante se observó un aumento en los niveles de transcripción de los genes otpA y ctpB, cuando la micobacteria se somete a condiciones de estrés por intoxicación de cationes, tiipoxia e inanición (Anexos 7 y 15). la comparación mediante absorción atómica de la acumulación de metales entre cepas de micobacteria silvestre, micobacterias sobreexpresando diferentes ATPasas tipo P, y/o mutantesen algunas ATPasas mostraron en cepas recombinantes donde se sobreexpresa en membrana una ATPasa tipo P-determnada-de M. tuberculosis, la micobacteria adquiere la capacidad de eliminar mayor cantidad de metal desde el interior celular, y que por el contrario, mutantes -en ATPasas pierden la capacidad de expulsar las concentraciones tóxicas de metal desde el interior celular. Además este ensayo en particular ayudó a determinar con exactitud que metal es acumulado por una célula -de micobacteria en la que se encuentra activada sobreexpreada) o reprimida una ATPasa -en particular, por lo tanto --definiendo la especificidad jónica así: CtpF (Ca2 ); CtpE (Naj; CtpA (Cu) y CtpB (Cu) (Anexos 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7). El conjunto de ensayos funcionales desarrollados en el proyecto demostraron que CtpE -(transportador -de Na+) no es un gen esenaal y -quela acumulación-de Na en un mutante de M. smegamtis defectivo en el homólogo de CtpE en esta especie es producto de un choque osmótico XAnexo 2), lo que sugiere que-no seria de' mayor utilidad evaluar la virulencia -de un mutante de M. tuberculosis defectivo en CtpE. Situación similar se observó con el mutante obtenido de M. tuberculosis defectivo en CtpA, aunque mostró evidencias cualitativas de atenuación (test de mjo neutro), los ensayos de absorción atómica mostraron que no existe-diferencia significativa en la acumulación de Cul entre la cepa silvestre y la mutante, que como en el caso anterior, no justifica realizar una evaluación de su virulencia en modelo celular (Anexos 3 y 7). Por lo tanto, el mejor candidato para realizar pruebas-preclínicas en modelo celular fue la cepa de M. hiberculos/s-defectiva-en CtpF. los ensayos de infección de macrófagos comparando la cepa salvaje, M. tuberculosis H37Rv, y el mutante defectivo en CtF (Mtb&tpF) demostraron -que la capacidad infectiva o-de ingresar al macrófago para ser fagocitada no 'se pierde con la +nutación, sin embargo, a los 3 y 7 dias post-infección se -disminuye significativamente la capacidad replicativa de¡ mutante en comparación con la cepa parental, lo que sugiere alteración de mecanismos de multiplicación de la micobacteria en el macrófago, demostrando la atenuación de la cepa mutante. La deleción de ctpF generó un desbalance en el transporte de calcio, afectando procesos vitales y -de supervivencia de¡ bacilo tuberculoso. En conclusión, los ensayos de infección demostraron -que efectivamente -el trasportador de Ca2 C{pF -está implicado -en la virulencia del bacilo tuberculoso (Anexo 5), y -este mutante se convertiria entonces en una -cepa atenuada -de -M. tuberculosis a ser probada su c4nética de infección en modelos animales, además de su potencial vacunal. S. CUMPL1MIENTO DE OBJETIVOS 5.1. Cumplimiento del(os) objetivo(s) general(es) 1 Determinar si el transporte mediado por las ATPasas tipo P CtpF, CtpE, CtpA y CtpB está % 100 de 100 OBJETIVO GENERAL: relacionado con la virulencia y/o la viabilidad de M. tuberculosis cumplimiento: 1 RESULTADO 1 ANEXO SOPORTE DEL DESARROLLO Y DIFICULTADES OBSERVACIONES OBTENIDO OBTENCIÓN DE RESULTADOS 1 Código: M301 PR03FO8 INFORME TÉCNICO DE AVANCE O FINAL DE PROGRAMAS Y Versión: 02 PROYECTOS DE CTeI Fecha: 2019-02-08 Página 5 de 30 Cumpliendo con el Anexo 1 Encontramos que al expresar En todos los casos la actividad cronograma establecido, Anexo 2 estas proteínas de membrana en ATPasa estuvo relacionada con la se realizó la Anexo 3 E. coli y aislarlas por viabilidad de M. tuberculosis caracterización de la Anexo 4 cromatografía de afinidad, se (determinación de MIC de cepas de actividad enzimática de Anexo 5 pierde significativamente la micobacteria sobreexpresando las cada uno de los Anexo 6 actividad de ATPasa en tiempos diferentes ATPasas). La transportadores Anexo 7 muy cortos, lo que no dificulta el caracterización bioquímica de las considerados (CtpF, Anexo 8 estudio de sus constantes cepas recombinantes CtpE, CtpA y CtpB) Anexo 9 cinéticas de proteína sobreexpresando las diferentes Anexo 11 recombinante reconstituida en ATPasas o mutantes sugieren que la liposomas. Por lo tanto se decidió mejor cepa para determinar la cinética determinar las constantes de infección es la defectiva en CtpF. cinéticas expresando las proteínas en la membrana plasmática de micobacteria. Las dificultades técnicas en la construcción y sobretodo en la purificación de los mutantes atrasaron el proyecto aproximadamente 18 meses. Finalmente se lograron obtener mutantes en M. tuberculosis, después de una selección se probó en modelo celular la cepa de M. tuberculosis H37Rv defectiva_en_CtpF. 5.2. Cumplimiento de los objetivos específicos OBJETIVO Determinar el efecto de la deleción individual de los transportadores CtpF, CtpE, CtpA y CtpB en 1 % 100 de ESPECÍFICO 1: la virulencia M. tuberculosis, cumplimiento: % ANEXO SOPORTE DEL 1 PRODUCTO RESULTADO OBTENIDO 1 (si aplica) DESARROLLO Y OBTENCIÓN OBSERVACIONES DE RESULTADOS Código: M301PR03FO8 INFORME TECNICO DE AVANCE O FINAL DE PROGRAMAS Y Version 02 PROYECTOS DECTeI Fecha: 2019-02-08 Página6 de 30 De acuerdo a los resultados obtenidos Tesis de Doctorado en Ciencias- Anexo 2 Inicialmente hubo problemas de de la caracterización de las cepas Bioquímica, Lorena Novoa Aponte. Anexo 5 selección clonal -de los mutantes recombinantes, se construyeron Potencial de las ATPasas tipo P como Anexo 6 iue retrasaron el proyecto durante, mutantes de CtpF, y CtpA. Se dianas terapéuticas o en el diseño de Anexo 7 18 meses. seleccionó para evaluar el efecto en la mutantes atenuados de Mycobacterium Anexo 9 virulencia el mutante defectivo en CtpF. tuberculosis", Facultad de Ciencias, Anexo 10 Universidad Nacional de Colombia, abril Anexo 11 2017 Anexo 12 Anexo 13 Tesis de Doctorado en Ciencias- Anexo 14 Bioquímica, Andrés Felipe León: Anexo 16 'Respuesta de las ATPasas tipo P1B a las condiciones de estrés en Mycobacterium tuberculosis", facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia septiembre2018 Tesis de Doctorado en Ciencias- Bioquímica (en marcha), Paola Andrea Santos Ruíz: "ATPasas tipo P de Mycobacterium tuberculosis como dianas para el diseño racional de compuestos antituberculosos" Tesis de Doctorado en Ciencias- Bioquímica (en marcha), Milena tvlaya Hoyos: "ATPasas tipo P como blancos para la atenuación de Mycobacterium tuberculosis". Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia Tesis de Maestría en Ciencias-Bioquímica, Cristian Rosales Hernández: "Determinación de características Código: M301 PR03FO8 INFORME TÉCNICO DE AVANCE O FINAL DE PROGRAMAS Y Versión: 02 PROYECTOS DECTeI Fecha: 2019-02-08 Página 7 de 30 funcionales de CtpF, una Ca2+-ATPasa tipo P de Mycobacterium tuberculosis". Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Mayo 2019. Articulo Sometido: Maya, M., Rosales, C., Novoa, L., castillo, E. and Soto. CY. "The P-type ATPase CtpF is a plasma membrane transporter mediating calcium efflux in Mycobacterium tuberculosis cells". Heliyon, Julio 2019. Articulo Sometido: Leon, A., Arango, E., Castillo, E., and Soto CY. 'CtpB isa plasma membrane copper (1) transporting P-type ATPase of Mycobacterium tuberculosis". Biological Research, junio 2019. Artículo Sometido: Santo, P., López, F., Ramírez, D., Caballero, J., mata, D., Hernández-Pando, R., and Soto CY. Identification of Mycobacterium tuberculosis CtpF as a target for designing new antituberculous drugs". European Journal of Medicine Chemistry. Octubre 2019. Presentación en Congreso: Vazquez, V. y Soto, CY. Construcción de un mutante de Mycobacterium tuberculosis defectivo en el transporte de dimicoserosato de ftiocerol y producción de un mutante no marcado de Mycobacterium smegmatis". XXIV Código: M301PR03F08 INFORME TECNICO DE AVANCE O FINAL DE PROGRAMAS Y Version 02 PROYECTOS DE CTeI Fecha: 2019-02-08 Página 8 de 30 Congreso latinoamericano de Microbiologia-IX Reunión de la Sociedad Latinoamericana de Tuberculosis y otras Micobacteriosis. Santiago de Chile, Noviembre 2018. Presentación en Congreso: Soto, CY. "ATPasas tipo P como dianas para el diseño de compuestos antituberulosos". XXIV Congreso latinoamericano de Microbiologia-IX Reunión de la Sociedad Latinoamericana de Tuberculosis y otras Micobacteriosis. Santiago de Chile, Noviembre 2018. 1 Determinar el perfil {ranscripcional de las ATPasas tipo P de M. tuberculosis OBJETIVO bajo condiciones de l estrés como hipoxia, inanición, concentraciones tóxicas de cationes metálicos, y especies de ESPECIFICO 2: 1 cumplimiento: 100 % reactivas de oxigeno y nitrógeno. RESULTADO OBTENIDO PRODUCTO ANEXO SOPORTE DEL (si aplica) DESARROLLO YOBTENCIÓN OBSERVACIONES DE RESULTADOS Se obtuvieron curvas de eficiencias y el Tesis de Doctorado en Ciencias- -Anexo 7 Ninguna perfil transcripcionai bajo Bioquímica, Andrés Felipe León: Anexo 11 concentraciones tóxicas de metales y "Respuesta de -las ATPasas tipo P18 a las Anexo 14 otras condiciones de estrés de los genes condiciones de estrés en Mycobacterium Anexo 15 sigA, ctpA, ctpB, ctpC, ctpD, ctpE, ctpH, tuberculosis" ctpJ yctpG, Articulo Sometido: Leon, A., Aíango, E., Castillo, E., and Soto CY. "CtpB is a plasma membrane copper (1) transporting P-type ATPase of Mycobacterium tuberculosis". Biological Código: M301 PRO3FO8 INFORME TÉCNICO DE AVANCE O FINAL DE PROGRAMAS Y Versión: 02 PROYECTOS DE CTeI Fecha: 2019-02-08 Página 9 de 30 Research, junio 2019. Establecer la tolerancia de los mutantes CtpF, CtpE, y CtpA y CtpB de OBJETIVO M. tuberculosis a 0/ de concentraciones tóxicas de iones ° ESPECI FICO 3: de metales alcalino/alcalinotérros y metales pesados 100 % cumplimiento: respectivamente RESULTADO OBTENIDO PRODUCT%.., ANEXO SOPORTE DEL DESARROLLO Y OBTENCIÓN OBSERVACIONES (si aplica) DE RESULTADOS Los experimentos de viabilidad celular al Tesis de Doctorado en Ciencias- Anexo 1 Ninguna sobreexpresar las ATPasas en M. Bioquímica, Lorena Novoa Apante. Anexo 2 smegmatis han permitido conocer las "Potencial de las ATPasas tipo P como Anexo 3 concentraciones adecuadas para probar dianas terapéuticas o en el diseño de Anexo 4 las diferentes cepas de micobacteria; a mutantes atenuados de Mycobac(erium Anexo 5 su vez que permitieron conocer que el tuberculosis", Facultad de Ciencias, Anexo 6 transporte mediado por las diferentes Universidad Nacional de Colombia, abril Anexo 7 ATPasas tipo Pa través de la membrana 2017 Anexo 14 plasmática está asociado con la Anexo 16 tolerancia de M. tuberculosis a los Tesis de Doctorado en Ciencias- Anexo 17 siguientes cationes de metales: Bioquímica, Andrés Felipe León: Anexo 18 CtpF: Na+ y Ca2+ "Respuesta de las ATPasas tipo P1B a las CtpE: Na+ o K+ condiciones de estrés en Mycobacterium CtpA: Cu+ tuberculosis, Facultad de Ciencias, CtpB: Cu+ Universidad Nacional de Colombia septiembre 2018 Tesis de Doctorado en Ciencias- Bioquimica (en marcha), Paola Andrea Santos Ruíz: Código: M301P903F"08 INFORME TÉCNICO DE AVANCE O FINAL DE PROGRAMAS Y Versión: 02 " PROYECTOS DE CTeI Fecha: 2019-02-08 Página 10de30 "ATPasas tipo P de Mycobacterium tuberculosis como dianas para el diseño racional de compuestos antituberculosos" Tesis de Doctorado en Ciencias- Bioquímica (en marcha), Milena Maya Hoyos: "ATPasas tipo P como tlancos para la atenuación de Mycobacterium tuberculosis", Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia Tesis de Maestría en Ciencias-Bioquímica, Cristian Rosales Hernández: "Determinación de caracteristicas funcionales de CtpF, una Ca2 -ATPasa tipo P de Mycobacterium tuberculosis". Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Mayo 2019. Artículo Aceptado: Maya, M., Rosales, C., Novoa, L., castillo, E. and Soto. CY. "The P-type ATPase CtpF is a plasma membrane transporter mediating calcium efflux in Mycobacterium tuberculosis cefis". Heliyon, Noviembre 2019. Articulo Sometido: Leon, A., Arango, E., Castillo, E., and Soto Cv'. "CtpB is a plasma membrane copper (1) transporting P-type ATPase of Mycobacterium tuberculosis". Biological Research, junio 2019. Código: M301 PRO3FO8 INFORME TÉCNICO DE AVANCE O FINAL DE PROGRAMAS Y Versión: 02 PROYECTOS DE CTeI Fecha: 2019-02-08 Página 11 de 30 Presentación en Congreso: León, A., and Soto, CY. "The P-type ATPase CtpB is associated to the copper (1) pumping across the Mycobacterium tuberculosis plasma membrane". Biomicroworld 2017, Madrid, España. OBJETIVO Establecer la afinidad iónica de los transportadores CtpF, CtpE, CtpA y CtpB de M. tuberculosis, % de 0/ ESPECIFICO 4: previamente purificados mediante técnicas recombinantes. cumplimiento: 100 Dtf d ANEXO SOPORTE DEL RESULTADO OBTENIDO 1 j (si aplica) DESARROLLO Y OBTENCIÓN OBSERVACIONES DE RESULTADOS Los experimentos de actividad Tesis de Doctorado en Ciencias- Anexo 1 Ninguna ATPasa en la membrana plasmática Bioquímica, Lorena Novoa Aponte. Anexo 2 estimulada por los posibles iones "Potencial de las ATPasas tipo P como Anexo 3 transportados, sumado a la dianas terapéuticas o en el diseño de Anexo 4 tolerancia de las cepas mutantes atenuados de Mycobacterium Anexo 5 recombinantes a concentraciones tuberculosis", Facultad de Ciencias, Anexo 6 tóxicas de los diferentes iones, y en Universidad Nacional de Colombia, abril Anexo 7 especial la determinación de los 2017 Anexo 9 parámetros cinéticos, nos indicaron Anexo 10 que la afinidad de las ATPasas por Tesis de Doctorado en Ciencias- Anexo 14 sus respectivos iones transportados Bioquímica, Andrés Felipe León: Anexo 16 es: "Respuesta de las ATPasas tipo P1B a las Anexo 17 condiciones de estrés en Mycobacterium Anexo 18 CtpF: Ca2+ tuberculosis", Facultad de Ciencias, CtpE: Na+ o K+ Universidad Nacional de Colombia CtpA: Cu+ . septiembre 2018 CtpB: Cu+. Tesis de Doctorado en Ciencias- Bioquímica (en marcha), Paola Andrea Santos Ruiz: "ATPasas tipo P de Mycobacterium Código: M301PR03FO8 INFORME TÉCNICO DE AVANCE O FINAL. DE PROGRAMAS Y Versión: 02 PROYECTOS DE CTeI Fecha: 2019-02-08 Página 12 de 30 tuberculosis como dianas para el diseño racional de compuestos antituberculosos" Tesis de Doctorado en Ciencias- Bioquímica {en marcha), Milena Maya Hoyos: ATPasas tipo P como blancos para la atenuación de Mycobacterium tuberculosis", Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia Tesis de Maestría en Ciencias-Bioquímica, Cristian Rosales Hernández: "Determinación de características funcionales de CtpF, una Ca2 -ATPasa tipo P de Mycobacterium tuberculosis". Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Mayo 2019. Artículo Aceptado: Maya, M., Rosales, C., Novoa, L., castillo, E. and Soto. CY. "The P-type ATPase CtpF is a plasma membrane transponer niediating calcium .efflux in Mycobacterium. kiberculosis celis". Heliyon, Noviembre 2019. Artículo Sometido: Leon, A., Aran9o, E., Castillo, E., and Soto CY. 'CtpB is a plasma menibrane copper (1) transportin9 P-type ATPase of Mycobacterium tuberculosis". Biological Research, Junio 2019. Presentación en Congreso: Código: M301PR03F08 INFORME TECNICO DE AVANCE O FINAL DE PROGRAMAS Y Version 02 PROYECTOS DE CTeI Fecha: 2019-02-08 Página 13 de 30 León, A., and Soto, CV. "The P-type ATPase CtpB is associated to the copper (1) pumping across the Mycobacterium tuberculosis plasma membrane". Biomicroworld 2017, Madrid, España. Presentación en Congreso: Rosales, C., Castillo, E. and Soto, CV. "Heterologous expression of Mycobacterium tuberculosis CtpF on Mycobacterium smegmatis cells". XXIV Congreso latinoamericano de Microbiologia-IX Reunión de la Sociedad Latinoamericana de Tuberculosis y otras Micobacteriosis. Santiago de Chile, Noviembre 2018. OBJETIVO Caracterizar la cinética enzimética de las ATPasas tipo P CtpF, CtpE, CtpA y CtpB de M. % de ESPECIFICO 5: tuberculosis cumplimiento: 1F'll I('T( ANEXO SOPORTE DEL RESULTADO OBTENIDO IIIIJU. 1 DESARROLLO Y OBTENCIÓN OBSERVACIONES (si aplica) DE RESULTADOS La determinación de actividad ATPasa Tesis de Doctorado en Ciencias- Anexo 1 Ninguna en vesículas de membrana de Bioquímica, Lorena Novoa Aponte. Anexo 2 micobacteria separadamente "Potencial de las ATPasas tipo P como Anexo 3 expresando cada ATPasa en estudio, dianas terapéuticas o en el diseño de Anexo 4 permitió determinar sus condiciones mutantes atenuados de Mycobacterium Anexo 7 óptimas de actividad. Todas ellas tuberculosis", Facultad de Ciencias, Anexo 10 presentaron un comportamiento Universidad Nacional de Colómbia, abril Anexo 14 michaeliano, obteniendo los siguientes 2017 parámetros cinéticos para sus iones más Código: M301PR031708 INFORME TÉCNICO DE AVANCE O FINAL DE PROGRAMAS Y Versión: 02 PROYECTOS DE CTeI fecha: 2019-02-08 Página 14 de 30 eficientemente transportados: Tesis de Doctorado en Ciencias- Bioquímica, Andrés Felipe León: CtpF: para Ca2+ (Km 0,27 hM y Respuesta de las ATPasas tipo P1B a las Vmax de 3,57±0,20 nmol/mg.min) condiciones de estrés en Mycobacterium tuberculosis", Facultad de Ciencias, CtpE: para Na+ (Km de 108,9±37,4 Universidad Nacional de Colombia hM y Vmax de 3,4±0,2 nmol septiembre 2018. P/niin.mg); K+Km de 19,6±2,8pM y Vmax de 3,16±0,07 nmol P/min.mg). Articulo Sometido: Leon, A., Arango, E., Castillo, E., and Soto CtpA: para Cu+ iKm 4,68 x 10-2 pM CY. CtpB is a plasma membrane copper y Vmax de 10,3 nmol/mg.min) l) transporting P-type ATPase of Mycobacterium tuberculosis". Biological CtpB: para Cu+ Km 0,19 pM y Vmax Research, Junio 2019. de 2,29 ± 0,10 nmollmg.min) 6. DESCRIPCIÓN DE OTROS RESULTADOS OBTENIDOS OTROS RESULTADOS INDICADOR DE DESCRIPCIÓN DEL CUMPLIMIENTO RESULTADO OBTENIDO ANEXO SOPORTE N/A NIA N/A N/A 7. RESULTADOS ADICIONALES DESCRIPCIÓN DEL RESULTADO ADICIONAL 1 ANEXO SOPORTE 1 Código: M301PR03FO8 INFORME TÉCNICO DE AVANCE O FINAL DE PROGRAMAS Y Versión: 02 PROYECTOS DE CTeI Fecha: 2019-02-08 Página 15 de 30 El modelo por nosotros planteado para la caracterización de los Anexo 11 transportadores de membrana ATPasas tipo P de M. tuberculosis, lo hemos Anexo 19 podido extrapolar para el estudio de¡ posible transportador de metales Anexo 20 pesados CtpG de M. tuberculosis, el que durante el transcurso de esta investigación, hemos encontrado que podria ser muy interesante como blanco terapéutico yio de atenuación contra M. tuberculosis. Esto originó dos productos: Tesis de Maestría en Ciencias Bioquimica, Ludy Viviana Quitián: Determinación de características funcionales de CtpG, una ATPasa tipo P transportadora de metales pesados de la membrana plasmática de Mycobacterium tuberculosis". Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, octubre 2017. Artículo publicado: López M, Quitian LV, Calderón MN, Soto CY. The P-type ATPase CtpG preferentially transports Cd2+ across the Mycobacterium tuberculosis plasma membrane. Arch Microbiol. 2018 Apr;200(3):483-492. doi: 10.1007/s00203- 017-1465-z. Epub 2017 Dec 2 8. CUMPLIMIENTO DE LA METODOLOGÍA El presente proyecto ha sido desarrollado utilizando la siguiente estrategia metodológica, basada en protocolos convencionales de bioquímica y biología mdlecular: 8.1. Expresión heteróloga de ATPasas tipo P de M. tuberculosis: Se expresaron las proteínas recombinantes en la micobacteria saprófita M. smegmatis mc2155 con el fin de obtener la proteína es un ambiente lipidico más cercano al natural. Para tal fin se construyeron plásmidos recombinantes en el shuttle vector (E. coli /Mycobacterium) pMV261, que permite la expresión de las proteínas bajo el control del promotor constitutivo de respuesta a estrés térmico, hsp60, sin etiquetas para su identificación con anticuerpos. Para todas las proteínas ha sido muy difícil evidenciar su expresión mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) debido a que pMV261 es un plásmido de bajo número de copias (Stover et al. 1991), solo se ha logrado purificando fracción de membrana. Sin embargo, los experimentos de actividad ATPasa en vesículas de membrana, y la tolerancia de células completas de M. smegmatis individualmente expresando las diferentes ATPasas de M. tuberculosis, han evidenciado el efecto en el transporte iónico a través de la membrana plasmática, lo que sugieren fuertemente su real expresión en el modelo seleccionado. En conclusión se cumplió y funcionó la metodología propuesta (Anexos 1, 2, 3 y 4, 11 y 14). Código: M301PR03F08 V. iI INFORME TÉCNICO DE AVANCE O FINAL DE PROGRAMAS Y LI Versión: 02 1 PROYECTOS DECTeI Fecha: 2019-02-08 Página 16 de 30 8.2. Extracción de membrana plasmática bacteriana: La membrana usada en los ensayos de actividad sobre vesículas se aisló como lo propuesto durante el disefio del proyecto, lo que básicamente consistió en usar las micobacterias resuspendidas en buifer de lisis (10 mM MOPS; 1 mM EDTA; 0,3 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo - PMSF; pH 7.4) mediante 8 ciclos de 1 min en un Mini Beadbeater-16 (Biospec). Una vez removidos los desechos celulares por centrifugación a 25000 x g por 30 min a 4°C, se tomaron los sobrenadantes (fracción de membrana y las citoplasmática) y se separon por ultracentrifugación (a 100.000 x g por 90 min a 4°C). La concentración de proteína en la membrana se determinó por el método de Bradford-Zor-Selinger(Bradford 1976). Las membranas se ajustaron a una concentración de 1 mg/mL y se almacenaron a -20°C hasta su uso. En conclusión se cumplió y funcionó la metodología propuesta (Anexos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 14, 15,16,17,18, 19y20) 8.3. Punficación de ATPasas tipo P por cromatografía de afinidad: La purificación de las proteínas se realizó por cromatografía de afinidad utilizando columnas de Agarosa-Níquel, partiendo de 1 litro de cultivo bacteriano (013500 de 6,0 aproximadamente) bajo las condiciones óptimas de expresión establecidas previamente. Una vez verificada la expresión de la proteína por Dot-Biot (para CtpF, CtpE, CtpA y CtpB, Anexos 1, 2, 3 y 4), las bacterias se lisaron y el usado celular se sometió a un esquema de centrifugación diferencial para aislar la membrana plasmática. Antes de iniciar la cromatografía los lípidos de membrana se separaron mediante el uso de detergentes, como por ejemplo n-dodecil -D-maItosido (DDM) al 1%. La fracción sin solubilizar se removió en un ciclo adicional de centrifugación a 100k x. En algunas ocasiones se detectaron bandas contaminantes que sugieren algo de degradación y co-elución con otras proteínas, lo que obligó a una -segunda purificación por cromatografía. Los extractos proteicos se almacenaron a 4°C mientras se realizaban los ensayos de actividad enzirnática. Las fracciones conteniendo la proteína recombinante se reunieron y concentraron usando un Centricon de corte 50 kDa (Millipore). La proteína pura se detectó mediante SDS-PAGE y Western-Blot . Para evitar pérdida de funcionalidad de la proteína, todo el proceso se çeatizó a 4°C y en presencia del inhibidor de proteasas PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo). Para continuar con la caracterización de las diferentes enzimas, se determinó la actividad ATPasa, en el que se utilizan como sustratos el ATP y los cationes posiblemente transportados y se determinó la tasa de hidrólisis de ATP por cuantificación del fosfato liberado. Ensayos paralelos y posteriores de actividad pNPPasa evidenciaron que la enzima fue muy inestable al remover los lípidos de la bicapa, perdiendo su actividad en cuestión de horas. Por lo tanto, se-decidió un cambio de estrategia para determinar las constantes cinéticas de las diferentes ATPasas (Anexos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11,, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20) utilizando enzima expresada-en la membrana plasmática de micobateria. Se cumplió con el.desarrollo de la metodología y el logro del objetivo propuesto, sin embargo la proteína obtenida no muestra la actividad necesaria para ser reconstituida en liposomas (Anexos 2 y 3). 8.4. Reconstitución de las proteínas puras en liposomas: De acuerdo al numeral anterior, debido a la pérdida rápida de actividad de la proteína purificada, se decidió íeemplazar la propuesta de estimar las constantes cinéticas de la proteína reconstituida en liposomas, por utilizar vesículas de membrana plasmática para determinar la actividad ATPasa de cada enzima estimulada por los posibles iones transportados y determinar así sus constantes cinéticas. (Anexos 1, 2, 3 y 4). 8.5. Transporte catiónico catalizado por las ATPasas tipo P de M. tuberculosis: En general, la cantidad óptima de proteína se determinó variando la proleina adicionada entre 1 y 11 pg. El pH óptimo se estableció variando el pH de las reacciones enzimáticas desde 3,0 hasta 9,0 (citrato para pH 3-6; MOPS para pH 7,4 y Tris para pH 8-9). El tiempo y la temperatura de reacción se optimizaron en el rango de 5 - 60 min y 4 - 60 °C, respectivamente. Las cinéticas enzimáticas se realizaron bajo condiciones óptimas de reacción variando la concentración de sustratos. los ensayos variando la concentración de cationes se realizaron en presencia de 1 mM ATP. En todos los casos la actividad atribuida al transportador se calculó como la diferencia entre la actividad de las vesículas de membrana .de células recombinantes y la actividad de vesículas aisladas de las células transformadas con el vector pMV261 vacio (control). los valores de Km y Vmax se calcularon utilizando el programa Prism 6 versión 6.0h, lo que permitió asignar las especificidades iónicas de las diferentes enzimas. En conclusión se cumplió y funcionó la metodología propuesta (Anexos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11,, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20). Código: M301PR03FO8 INFORME TÉCNICO DE AVANCE O FINAL DE PROGRAMAS Y Versión: 02 PROYECTOS DE CTeI Fecha: 2019-02-08 Página 17 de 30 8.6. Tolerancia de los mutantes de M. tuberculosis a concentraciones tóxicas de cationes metálicos: Células de M. smegmatis mc2155 cepa silvestre, recombinante, se cultivaron en medio Middlebrook 71-19 hasta fase exponencial. 1350 pL de cultivo bacteriano ajustados a 00600 = 0,1 se mezclaron separadamente en placas de 24 pozos con 150 pL de solución estéril de las sales para lograr concentraciones finales sub-letales. Las bacterias se incubaron a 37°C por 4 h y se determinaron los valores de 0D600 finales. Células cultivadas en medio nutritivo sin adición de cationes y en presencia de antibiótico se incluyeron como controles positivo y negativo. Sus valores de 0D600 se asignaron con 100% y 0% de crecimiento, respectivamente. Los porcentajes de crecimiento se calcularon como: % de crecimiento bacteriano = [(00600 final - 0D600 control negativo)/ 00600 control positivo] * 100. Se cumplió y funcionó la metodología propuesta (Anexos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11,, 14, 15, 16, 17, 18, 19y20). 8.7. Análisis transcripcional de las ATPasas tipo P en respuesta a sustancias tóxicas asociadas con la infección tuberculosa: Esta parte del proyecto se desarrolló siguiendo la estrategia experimental que básicamente consiste en cuantificar la transcripción de las ATPasas tipo P en células de M. tuberculosis cultivadas bajo las diferentes condiciones de estrés propuestas en el proyecto. Para ello, se aisló el ARN de células de M. tuberculosis utilizando el método del TRlzol® (Invitrogen, USA) y fue tratado con DNasas para asegurarse de eliminar posible ADN genómico presente. A partir 2 pg de ARN extraído se sintetizó ADNc usando el kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Thermo Scientific). Los niveles de transcripción de los genes han sido analizados mediante PCR en tiempo real, utilizando el kit EXPRESS SYBR® GreenERTM qPCR SuperMix (lnvitrogen, USA), en un termociclador CFX-96 (Biorad, USA). En todos los casos se utilizó como normalizador el gen sigA y se hizo una cuantificación relativa usando el método de Pfaff que considera la eficiencia de amplificación de cada juego de primer usado. Se determinó la influencia de condiciones de estrés en la expresión para ctpA, ctpB, ctpC, ctpD. ctpG, ctpJ y ctpV (Anexo 7, 15 y 17). 8.8. Ensayos de acumulación de metales: Inicialmente se hizo la puesta a punto del protocolo propuesto para determinar mediante absorción atómica la acumulación de Ca2 , Na, K, y Cu. Para esta parte del proyecto las células de micobacteria control (salvaje), o separadamente sobreexpresando las ATPasas en estudio, o mutantes defectivos en las algunas de las ATPasas, son digeridas con ácidos nítricos fumantes y analizados mediante espectroscopía de absorción atómica. Para evaluar la acumulación, las vesículas son lavadas y resuspendidas en una solución estéril que contiene al catión a una concentración específica (Anexos 5, 6, 7, 11, 14, 16 y 18). Se comparó la acumulación entre diferentes cepas y las cepas control. Este protocolo fue uno de los que mayor información bridó a los objetivos y resultados finales de este proyecto, se cumplió 100% con los objetivos propuestos con este protocolo. 8.9. Determinación de la estequiometría de unión a cationes: Este ensayo que permite determinar el número de iones que une una ATPasa tipo P en cada ciclo catalítico y la dirección de su transporte, se hizo innecesario para para determinar la especificidad iónica de las diferentes bombas ATPasas en estudio. 8.10 Influencia de la deleción de las ATPasas tipo P en la virulencia de M. tuberculosis: Para determinar el efecto de la deleción mediante recombineria del gen ctpf del genoma de M. tuberculosis H37Rv, básicamente se realizó un ensayo de infección en macrófagos alveolares de ratón BALB/c. Para ello, se hizo un ensayo de infección in vitro usando una MOl de 1:2 (lx 105 células: 2x 105 bacterias) en placas de 12 pozos. Las células infectadas con la suspensión bacteriana se incubaron durante 1 hora a 37°C 5% CO2 para permitir el contacto y la fagocitosis. Pasado el tiempo de incubación, se las células se lavaron con RMPI+antibiótico para retirar la micobacteria extracelular. Posteriormente, se reconstituyeron de las células infectadas adicionando RMPI+10% SFB y se incubaron a 37°C 5% CO2 a diferentes Código: M301 PR03FO8 k3 INFORME TÉCNICO DE AVANCE O FINAL DE PROGRAMAS Y Versión: 02 PROYECTOS DE CTeI Fecha: 2019-02-08 Páginal8de30 t4empos 1 hora, 1 día, 3 días y 7 días) para analizar el proceso infectivo. Transcurrido el tiempo de infección, los macrófagos alveolares se usaron afiadiendo SOS al 0,1% y con este -lisado se hicieron diluciones seriadas para determinar las unidades formadoras de colonia en medio 71-110-0ADC. Para cada tiempo-de infección -la determinación de las IJFC se hizo por triplicado biológico y el resultado se expresó como el promedio de UFC/mL. Siguiendo el anterior procedimiento se -encontró que a 1 hora las cepas mostraron la misma capacidad infectiva o de ingresar al macrófago para ser fagocitada. Sin embargo, al transcurrir el proceso de infección en los tiempos de 3 y 7 días post-infección, se observó una disminución significativa en la capacidad plicat-iva de la cepa mutante (Mtb&tpF) en comparación con la -cepa parental. Lo anterior, sugirió que la deleción del gen ctpF en M. tuberculosis alteró mecanismos en la bacteria para sobrevivir y «lultiplicarse -en el macrófago, demostrando -la atenuación de la cepa mutante. Por lo anterior, la -deleción de ctpF una -AT-Pasa tipo P de M. tuberculosis generó un desbalance en el transporte de calcio, afectando procesos vitales y de supervivencia del bacilo tuberculoso. De hecho, el mutante defectivo en el gen cÍpF presentó una atenuación durante los procesos de infección en macrófagos alveolares (Anexo 5). Todo -esto concluye que efectivamente el transporte de Ca2+ a través de la membrana plasmática estaría implicado en la virulencia de M. tuberculosis. Se ti-ala de un excelente punto de partida para la construcción racional de mulantes atenuados de M. tuberculosis con potencial vacunal. 9. CRONOGRAMA DE EJECUCIÓN A LA FECHA, DIFICULTADES Y PLAN DE CONTINGENCIA CAMBIOS OBJETIVO FECHA DE PLAN DE CONTINGENCIA ACTIVIDADES APROBADOS POR RELACIONADO EJECUCION COLCIENCIAS (si aplica) (si_aplica) Expresión heteróloga de Establecer la afinidad Mes 1 - 8 NIA El análisis se tardó 4 +neses más de lo programado ATPasas tipo P y ensayos de iónica de los inicialmente, sin embargo permitió conservar con el actividad ATPasa dependiente transportadores CtpF, cronograma .general del proyecto de catión CtpE, CtpA y CtpB de M. tuberculosis, previamente purificados nediante técnicas recombinantes. Purificación de ATPasas tipo P Establecer la afinidad Mes 3 - 7 N/A - N/A por cromatografía -de afinidad iónica de los - transportadores ctpF, CtpE, CtpA y CtpB de M. tuberculosis, previamente purificados mediante técnicas recombinantes. Código: M301 PR03FO8 INFORME TÉCNICO DE AVANCE O FINAL DE PROGRAMAS Y Versión: 02 PROYECTOS DE CTeI Fecha: 2019-02-08 Página 19 de 30 Reconstitución de las Establecer la afinidad Como se aclaró en el numeral 8.3 y 8.4 la proteínas puras en liposomas jónica de los purificación de las proteínas para su reconstitución y análisis de transporte transportadores CtpF, Mes 6- 14 NIA en liposomas, derivó en alteración significativa de CtpE, CtpA y CtpB de M. la actividad enzimática (Anexos 1, 2, 3, 4, 11 y 14), tuberculosis, previamente dificultando el estudio de los parámetros cinéticos. purificados mediante Para solucionar este inconveniente, se decidió técnicas recombinantes. utilizar unos sistemas mucho más aproximados a las condiciones naturales de estos transportadores, o sea, su expresión y determinación de actividad directamente en la membrana plasmática micobacteriana. Esta circunstancia generó que este análisis se tardara 4 meses más de lo programado inicialmente, sin embargo permitió conservar con el cronograma general de¡ proyecto Análisis transcripcional de las Determinar el perfil ATPasas tipo P en respuesta a transcripcional de las Mes 10- 14 NIA NIA sustancias tóxicas asociadas ATPasas tipo P de M. con la infección tuberculosa en tuberculosis bajo cepas mutantes y sobre condiciones de estrés expresadas como hipoxia, inanición, concentraciones tóxicas de cationes metálicos, y especies reactivas de oxigeno y nitrógeno. Primer informe de Actividades. NIA Análisis de resultados Mes 11 - 12 NIA NIA parciales. Preparación de Manuscritos. N/A Mes ll-12 NIA NIA Código: M30IPR03FO8 INFORME TECNICO DE AVANCE O FINAL DE PROGRAMAS Y Version 02 y, PROYECTOS DECTeI Fecha: 2019-02-08 Página 20 de 30 Ensayos de Acumulación de Determinar la relación de la Mes 12— 16 N1A Como se explicó en oficio (8.DFC-1 10-18) remito metales. actividad ATPasas tipo P Mes 16-24 con fecha 14 de marzo, la no disponibilidad de mediada por CtpF, CtpE, (prorroga) clones de mutantes puros generó retraso en los CtpA y CtpB con la análisis del proyecto que estaban programados viabilidad de las desde el mes 16. Se solic#ó entonces una prórroga: micobacterias. de 12 meses, la que fue otorgada por Colciencias. Por lo tanto este ensayo de acumulación de metales se prorrogó hasta el mes 24 del proyecto. Determinación de la Caracterizar la cinética N/A estequiometría de unión a enzimática de las ATPasas Mes 13-18 NIA cationes en cepas sobre tipo P CtpF, CtpE, CtpA y expresadas CtpB de M. tuberculosis. Influencia de la delecián de Determinar el efecto de la Mes 24-36 N/A Como se solicitó en oficio (B.DFC-110-18) con las ATPasas tipo P de M. deleción individual de los (prorroga) fecha 14 de marzo de 2018, la no disponibilidad de tuberculosis en su tranportadores CtpF, CtpE, clones de mutantes puros -generó retraso en los virulencia con cepas CtpA " y CtpB en la virulencia análisis del proyecto que estaban .programados mutantes, recombinadas M. tuberculosis, silvestres desde el mes 16. Se solicitó entonces una prorroga de 12 meses, la" fue otorgada por Colciencias. Por lo tanto los ensayos de virulencia se prolongaron ti asta el mes 36. Análisis de Resultados Mes 36-40 N/A Como se solicitó en oficio (B.DFC-223-2019) con finales. Entrega de Informe N/A (prorroga) fecha 18 de marzo de 2019, la no disponibilidad de final y manuscritos clones de -mutantes puros -generó retraso en los análisis del proyecto que estaban programados desde el mes 16, lo que afectó la elaboración de manuscritos para publicar. Se solicitó entonces una prórroga de 4 meses, la que fue otorgada por Colciencias. La -preparación de informes y manuscritos se prolongó hasta -el mes 40 octubre 2019), fecha del informe final. Código: M301PR03F08 INFORME TÉCNICO DE AVANCE O FINAL DE PROGRAMAS Y Versión: 02 PROYECTOS DE CTeI Fecha: 2019-02-08 Página 21 de 30 10. PROYECCIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS FRENTE A LOS IMPACTOS REGISTRADOS EN EL PROYECTOIPROGRAMA(Si APLICA) TIPO DE IMPACTO DESCRIPCIÓN DEL IMPACTO PROYECCIÓN DEL IMPACTO De generación de nuevo conocimiento: Se espera que los resultados derivados de En la actualidad se tiene un artículo sometido a la presente investigación sean publicados publicación (Anexo 8), y se empezará con la en al menos tres artículos científicos. Dos elaboración de un nuevo manuscrito sobre CtpA y publicados y uno sometido a revistas ctpB en el segundo semestre de 2017 y otro al final internacionales de alto impacto, lo que .cle la investigación en el segundo semestre de 2018 contribuirá significativamente al conocimiento de los sistemas de transporte de membrana plasmática de M. tuberculosis. Apropiación social de conocimiento: Se espera dar a conocer los conocimientos Resultados parciales de este proyecto se derivados de la presente investigación en al presentarán en un evento académico internacional menos dos eventos académicos. en el-segundo semestre de 2017 XAnexo 9) Productos esperados de actividades relacionadas con la El desarrollo de la investigación tendrá la Un estudiante de Doctorado acaba de sustentar su formación de recurso humano para la CTI: dirección del Profesor Carlos Yesid Soto del Tesis Doctoral (Lorena Novoa, Doctorado en departamento de Química de la Universidad Ciencias-Química, Departamento de Química) en el Nacional de Colombia, y durante ella se tema del proyecto. En la actualidad se encuentran obtendrá la graduación de un estudiante de vinculados dos .estudiantes más del Doctorado en doctorado, la vinculación de dos estudiantes Ciencias-Bioquímica, del iJepartamento de de doctorado y uno de maestría, así como Química, (Milena Maya y Andrés León), y una la formación de un estudiante de pregrado. estudiante de Maestría en Ciencias-Bioquímica Todos los anteriores se estrenarán en (Laudy Quitián) y del pregrado en Química -(Laura métodos de investigación en bioquímica y Gil), de la Universidad Nacional de Colombia microbiología molecular aplicados al estudio (Anexo 13) de las micobacterias. Código: M301PR03FO8 INFORME TÉCNICO DE AVANCE O FINAL DE PROGRAMAS Y Versión: 02 PROYECTOSDECTeI Fecha: 2019-02-08 Página 22 de 30 ASPECTOS FINANCIEROS Ver anexo 21 12. DISCUSIÓN Y ANÁLISIS Los múltiples ambientes que M. tuberculosis puede ocupar durante la infección en humanos explican la variedad de defensas que la bacteria ha desarrollado durante su evolución, entre ellas el gran número de ATPasas tipo P. Para sobrevivir a dichos ambientes cambiantes, la micobacteria debe sensar, responder y adaptarse rápidamente a las nuevas condiciones de tal forma que pueda soportar condiciones como pH ácido, hipoxia, inanición, especies reactivas de nitrógeno y oxigeno, concentraciones tóxicas de cationes metálicos, entre otras (Murphy & Brown 2008; Soldati & Neyrolles 2012). En cierta medida, dichas respuestas son especificas y pueden evidenciarse por cambios en los niveles transcripcionales y en los perfiles de síntesis de proteínas posterior a la exposición a dichas condiciones de estrés. La mayoría de ATPasas tipo P de M. tuberculosis se activan in vivo (principalmente ctpF, ctpG, ctpC, ctpA y ctp, sugiriendo que se trata de factores que favorecen la persistencia de la bacteria dentro de células del hospedero y cuya inhibición podría afectar la virulencia y/o viabilidad del patógeno durante la infección. De acuerdo a nuestros análisis previos, la distribución de ATPasas tipo P en el género Mycobacterium sugiere que las especies patógenas se hicieron a un repertorio más grande y por tanto más versátil de estos transportadores activos en comparación con sus parientes ambientales. Por ejemplo, el número de ATPasas tipo P del patógeno M. tuberculosis (12 en total), duplica el número de estas bombas codificadas en el genoma de micobacterias saprófitas como M. smegmatis (6 ATPasas). Decidimos explorar características funcionales de las ATPasas tipo P, CtpF, CtpE CtpA y CtpB debido a que exhiben particularidades interesantes como posibles para ser consideradas posibles dianas terapéuticas y/o blancos de atenuación. CtpF es la bomba tipo P que más se sobre-expresa bajo condiciones de estrés relacionadas con la infección, por lo que debería ser requerida para la persistencia intracelular del patógeno, y estar relacionada con la atenuación del bacilo tuberculoso. Los diferentes resultados hasta ahora obtenidos nos han permitido sugerir que CtpE es una Na+ ATPasa involucrada en la respuesta micobacteriana al choque osmótico, en tanto que CtpF se comporta como Ca?* ATPasa encargada de exportar el catión hacia el exterior celular. Por su parte, los posibles transportadores de metales pesados, CtpA y CtpB, han mostrado ser enzimas relacionadas con el eflujo de Cu~ desde el interior de la micobacteria, al que entra como Cu2 y sufre un proceso de reducción a Cu, por lo tanto otorgando funciones a esos transportadores en la detoxificación de las micobacterias. Es necesario tener presente que, a pesar de que estas proteínas involucradas en la homeostasis iónica micobacteriana se estudiaron como actores aislados, ellos deben actuar en una misma célula en eventos concertados, lo que se puede evaluar mediante el análisis de su perfil transcripcional en condiciones de estrés. Hemos observado que las ATPasas estudiadas tienen como temperatura óptima de actividad 37°C sugiriendo que son activas durante la infección de hospederos como el humano. En lo que respecta al pH óptimo de reacción, se ha establecido que el pH del compartimento en el que reside M. tuberculosis dentro de los macrófagos varía entre 6,2 y 4,5 (Vandal et al. 2009), por lo que uno esperaría que aquellas bombas que se activen durante la infección tengan su máximo de actividad en valores de pH ácido. No obstante, se ha determinado que la micobacteria usa varios mecanismos para mantener el pH intracelular cercano a 7, aún en valores pH externo de 5 (Vandal et al. 2009), lo que parcialmente explica el hecho de que las ATPasas en estudio tengan valores óptimos de pH cercanos a la neutralidad. El valor de la constantes catalíticas (Vmax/Km) de CtpF para el transporte de Ca2 , indica que esta enzima es aparentemente un transportador de Ca2 eficiente, por lo que podría especularse que actúa cuando la micobacteria enfrenta una fluctuación repentina de iones este catión, por ejemplo durante la exposición a condiciones de estrés oxidativo como se ha observado en otras bacterias patógenas. Todos estos indicios, junto con la distribución variable de CtpF en el género Mycobacterium sugieren que CtpF hace parte de los mecanismos que M. tuberculosis adquirió durante su evolución para adaptarse a su estilo de vida patogénica, resaltando aún más el potencial de CtpF como diana terapéutica. Por su parte, el hecho de que CtpA y CtpB expulsen Cu+ y no Cu2+ del interior de la micobacteria, claramente Código: M301 PRO3FO8 INFORME TÉCNICO DE AVANCE O FINAL DE PROGRAMAS Y , Versión: 02 = 1 PROYECTOS DE CTeI Fecha: 2019-02-08 Página 23 de 30 plantea que al como respuesta a la infección el macrófago aumenta considerablemente su concentración de Cu2 , el que entre al interior de la micobacteria por diferentes vías, y debido a las fuertes condiciones reductoras del interior de la micobacteria, el cobre sufre un reducción al estado +1, el que debe ser expulsado para conservar la homeostasis jónica, siendo por ello que le asignamos características de detoxificación a estas bombas transportadoras de metales pesado. Se ha demostrado que la deleción de las ATPasas tipo P conlleva a atenuación de la virulencia de M. tuberculosis (Padilla-Benavides et al. 2013; Botella et al. 2011; Raimunda et al. 2014; Patel et al. 2016; Ward et al. 2010). Esto resulta de gran interés, ya que en la actualidad, se está optando por identificar dianas cuya inhibición afecte la virulencia más que la viabilidad de la bacteria, debido a que esta aproximación no media directamente la muerte de la bacteria sino que la desarma", deteniendo su crecimiento y por ende aplicando menor presión selectiva, además de varias ventajas adicionales: (i) un repertorio más grande de dianas farmacológicas; (u) generación de antimicrobianos con nuevos mecanismos de acción; y (iii) no afectación dramática de la microbiota del hospedero. Además, fármacos que bloqueen sistemas centrales, como el transporte jónico mediado por ATPasas tipo P, podrían tener espectros de actividad más amplios, toda vez que son sistemas preservados por todos los patógenos. El misterio está en encontrar la forma de inhibir la bomba del patógeno sin alterar la de su hospedero, campo en el que nuestro grupo de investigación trabaja arduamente en la actualidad. Por otro lado, dicha atenuación ocurrida al remover algunas de las ATPasas tipo P del genoma de M. tuberculosis supone un panorama favorable a la hora de pensar en el desarrollo de vacunas atenuadas. Y es que a pesar de haber sido administrada a más dé tres mil millones de personas, la actual vacuna anti-TB ha fallado en controlar la enfermedad. Los recientes proyectos en desarrollo de vacunas anti-TB se han enfocado en desarrollar una vacuna capaz de bloquear la infección inicial, en contraste con BCG, que protege principalmente contra la replicación descontrolada y diseminación del bacilo. Por ello, seria más ventajoso tener una vacuna derivada directamente de M. tuberculosis, que causa TB en humanos, en lugar de una derivada de M. bovis (origen de la actual vacuna BCG), que causa TB en vacunos. Una potencial ventaja del uso de vacunas vivas anti-TB, atenuadas y derivadas de M. tuberculosis es poder generar una mejor inducción de la respuesta inmune, debido a que el perfil antigénico de la vacuna seria más cercano al de las cepas virulentas de M. tuberculosis (Hingley-Wilson et al. 2003). El que hayamos encontrado que efectivamente el trasportador de Ca2 CtpF está implicado en la virulencia del bacilo tuberculoso (Anexo 5), y que un mutante defectivo de este transportado tiene muy buena atenuación, abre una puerta muy importante en el estudio esta cepa atenuada de M. tuberculosis a ser probada su cinética de infección en modelos animales, además de su potencial vacuna¡. 13. CONCLUSIONES (incluir trabajo futuro) Consideramos que nuestra estrategia ha sido hasta ahora una valiosa herramienta para el entendimiento de los eventos responsables del transporte activo de cationes a través de la membrana plasmática de M. fuberculsois, por lo que este trabajo, nos permite concluir que: i. CtpE es una Nal ATPasa debido a varios factores: para empezar, células sobre-expresando CtpE fueron más tolerantes a dosis sub-letales de Na comparado con células control, en tanto que la cepa de micobacteria defectiva en el gen cfpE fue más susceptible a cationes monovalentes (Na, K, NH4, colina+) en comparación con la cepa silvestre. Además dicha cepa mutante acumuló mayores niveles celulares de iones Na, en comparación con la cepa silvestre. En concordancia, la actividad ATPasa de vesículas de membrana plasmática enriquecidas con CtpE aumentó en función de la concentración de Na y K siguiendo una cinética de Michaelis-Menten, con actividad enzimática máxima a pH 7,4 y 37°C, actividad específica de 3,4±0,2 nmol P/min.mg, y afinidad por Na+ (Km 108,9 pM. Estos resultados en suma sugieren que CtpE puede hacer parte de la respuesta micobacteriana al choque osmótico que enfrenta en el transcurso de la infección. CtpF tiene una actividad enzimática máxima (3,57 nmol/mg.min) que se logró a pH 7,4 y 37°C, con gran afinidad por Ca2+ (Km 0,27 pM), y menor afinidad por ATP (Km 436,3 pM). Estos resultados sugieren que CtpF participa en el transporte activo de calcio desde el citoplasma de M. tuberculosis. Acorde a ello, su sobreexpresión confiere tolerancia a la bacteria recombinante frente a concentraciones tóxicas de Ca2 y Na, sugiriendo que es posible que la micobacteria use un Código: M301 PR03F08 . INFORME TÉCNICO DE AVANCE O FINAL DE PROGRAMAS Y . Versión: 02 1 PROYECTOS DE CTeI Fecha: 2019-02-08 Página 24 de 30 mecanismo regulatorio Ca2 -dependiente como respuesta a sustancias activas redox, lo que la hace relevante para la virulencia tal -como lo demostrado en el modelo -celular de macrófagos. Los parámetros cinéticos de CtpA fueron determinados midiendo la actividad Cu ATPasa producida por la bomba bajo diferentes condiciones. Se encontró que la enzima presenta una actividad óptima cuando en la reacción se utilizan 4 pg de proteína de vesículas de membrana, un pH de 7,5 y una temperatura de 37 O y las constantes cinéticas son: Vmax de 10,3 nmol/mg.min, Km de 4,68 x 10-2 pM deCu+ y h de 1,91. Mutantes de M. tuberculosis -defectivos -en este transportador no mostraron diferencia en la acumulación del Ca2 en ambientes de alta concentración de este cation, lo que lo descarta directamente como un posible factor de virulencia. .CtpB tiene estimulación de la actividad ATPasa al adicionar Cu en el medio de reacción, y las constantes cinéticas son Km de 0,19 pM y Vmax•de 2,29 ± 0,10 nmollmg.min. Aunque CtpB es activada por algunas condiciones de .estrés características del ambiente intrafagosomal, Mutantes de M. tuberculosis defectivos en este transportador no mostraron diferencia en la acumulación del Ca2 en ambientes de alta concentración de este cation, lo que lo descarta directamente como un posible factor de virulencia. y. Los diferentes ensayos fundonales (Actividad ATPasa y determinación de la acumulación de metales .en el interior celular) demostraron-quela especificad iónica de algunas de las ATPasas encargadas-del transporte iónico en 4a membrana plasmática y la desintoxicación en respuesta a elevadas concentraciones iónicas es la siguiente: C{pFCa2+); CtpENa); CtpHCa2 ), CtpA-(Cu), CtpB Cu) y CtpGiCd2 ). vi. Los ensayos de infección en macrófagos murinos permitió demostrar que el transportador de Ca2 , CtpF, de la membrana plasmática, está directamente relacionado con la virulencia de M. tuberculosis, por lo que cepas de bacilo tuberculoso defectivos-en este transpotador se comportan-como atenuadas .en modelos de infección. En conclusión, -nuestra-estrategia experimental basada en sobre-expresión ydeleción de las proteínas estudiadas acompafiada de estudios bicinformáticos nos han permitido sugerir que las proteínas CtpE, CtpF, CtpA y CtpB hacen parte de los elementos involucrados en -la interacción hospedero-patógeno de M. tuberculosis, contribuyendo en el establecimiento de la infección tuberculosa. Al estar estos tranportadores relacionados con la viabilidad celular, se pueden postular-como dianas del bacilo tuberculoso a ser estudiadas en -el desarrollo de compuestos anti-TB, o para con alguno de ellos obtener cepas atenuadas útiles en el desarrollo de mutantes atenuados de M. tuberculosis, como lo realizado con CtpF en este trabajo. En este sentido se debe estudiar a fondo el potencia vacunal del mutante atenuado de M. tuberculosis defectivo en CtpF, lo que correspondería a una Fase 3 del presente proyecto. En el desarrollo de compuestos antituberculosos utilizando las ATPasas tipo P de membrana plasmática como -dianas, en este trabajo ya se han -dado pasos significativos, encontrando por screening virtual y Docking molecular, algunas sustancias que inhiben la actividad ATPasa de la membrana plasmática, y disminuyendo de manera significativa la viabilidad de las micobacterias, demostrando que estos blancos son drogables para -el desarrollo 1uttiro de nuevos -compuestos anti-TB. 14. SIGLAS Y ABREVIATURAS Código: M301 PR03FO8 INFORME TÉCNICO DE AVANCE O FINAL DE PROGRAMAS Y Versión: 02 PROYECTOS DE CTeI Fecha: 2019-02-08 Página 25 de 30 Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) Tuberculosis (TB) Antituberculosos (anti-TB) Escherichia coli (E. cali) Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsuifato sádico (SDS-PAGE, de su sigla en inglés) Constante de Michaelis-Menten (Km, de su sigla en inglés) Velocidad máxima (Vmax) Medio de cultivo Luna Bertani (LB) Columna de Níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) Acvidad p-nitrofenil fosfatasa (pNPPasa, por sus siglas en inglés) 15. REFERENCIAS Bradford, M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principie of protein-dye binding. Analyticai Biochemistry, 72(1-2), pp.248-254. Botella, H. et al., 2011. Mycobacterial Pi-Type ATPases mediate resistance (o Zinc poisoning in human macrophages. Ceil Host and Microbe, 10(3), pp.248-259. Broset, E., 2015. 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